在分離小鼠原代胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）時，需特別注意以下操作細(xì)節(jié)以確保細(xì)胞活性和功能完整性：

1. 組織處理時效性
離體胃組織應(yīng)在冰上預(yù)冷的PBS中快速轉(zhuǎn)移至超凈臺，從處死小鼠到開始消化步驟盡量控制在15分鐘內(nèi)，避免缺血導(dǎo)致的細(xì)胞膜完整性損傷。若需暫存，可將胃組織置于4℃預(yù)充95%O?/5%CO?的Krebs緩沖液中，但不宜超過30分鐘。

2. 酶解條件優(yōu)化
推薦采用Ⅺ型膠原酶（1.5mg/ml）與分散酶（2.4U/ml）聯(lián)合消化，37℃震蕩水浴時間嚴(yán)格控制在25-30分鐘。每10分鐘輕柔吹打一次，鏡下觀察到組織呈絮狀時應(yīng)立即終止消化。過度消化會破壞ICC特有的突觸結(jié)構(gòu)，影響后續(xù)自發(fā)節(jié)律性檢測。

3. 梯度離心純化
采用Percoll非連續(xù)密度梯度離心（25%/40%）時，離心機(jī)需提前預(yù)冷至4℃，800g離心20分鐘后，目標(biāo)細(xì)胞主要分布于界面層。需注意吸管尖端需硅烷化處理，避免ICC因表面電荷特性而貼壁損失。

4. 培養(yǎng)條件控制
接種時使用經(jīng)纖連蛋白包被的35mm玻底培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基建議采用含SCF（20ng/ml）和胰島素（5μg/ml）的DMEM/F12。培養(yǎng)箱需維持10%CO?環(huán)境，這對維持ICC膜電位穩(wěn)定性至關(guān)重要。首次換液應(yīng)在接種48小時后進(jìn)行，避免擾動貼壁。

5. 功能驗(yàn)證節(jié)點(diǎn)

培養(yǎng)72小時后需進(jìn)行c-Kit免疫熒光鑒定（建議使用Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗），同步通過膜片鉗檢測典型起搏電流（如ANO1通道電流）。若發(fā)現(xiàn)自發(fā)節(jié)律異常，可嘗試補(bǔ)充氯化血紅素（50μM）恢復(fù)線粒體功能。

特別注意：操作全程需避光，因ICC對藍(lán)光敏感；所有試劑需經(jīng)0.1μm濾膜除菌，內(nèi)毒素含量需＜0.01EU/ml。建議設(shè)立陽性對照組（如小腸ICC）以評估胃特異性ICC的分離效率。
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